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KOD-Plus-Neo產(chǎn)品說明書

更新時(shí)間:2023-11-17      點(diǎn)擊次數(shù):3522

        KOD-Plus-Neo是基于一種ji端嗜熱的海洋古生菌Thermococcus kodakarensisDNA聚合酶。這種聚合酶由于其高效的3’-5核酸外切酶活性(校對(duì)活性)。該產(chǎn)品含有一種du特的延伸增強(qiáng)劑",可抑制傳統(tǒng)PCR產(chǎn)生的平臺(tái)效應(yīng)"。因此,與先前版本的KOD-PlusKOD-201)相比,該試劑表現(xiàn)出更高的擴(kuò)增效率和延伸能力。此外,這種酶對(duì)于PCR延伸步驟僅需要30/kb。這有利于長(zhǎng)片段PCR。這種酶含有兩種抑制聚合酶3’-5’核酸外切酶活性的抗KOD DNA聚合酶抗體和,從而支持熱啟動(dòng)PCR

產(chǎn)品特點(diǎn)

普通Taq DNA聚合酶高80倍的PCR保真度

與傳統(tǒng)PCR相比,延伸增強(qiáng)劑"能夠?qū)崿F(xiàn)更高的擴(kuò)增效率和延伸能力

1.png

PCR延伸步驟只需要30/kb

兩步循環(huán)條件可用于使用≥20 mer引物的擴(kuò)增(退火溫度,Tm>63°C)。

2.jpg 

產(chǎn)品組分

KOD -Plus- Neo (1.0 U/μL)*

200 μL×1

10 x PCR Buffer for KOD -Plus-Neo

1 mL×1

25 mM MgSO4

1 mL×1

2 mM dNTPs

1 mL×1

 

引物設(shè)計(jì)

引物應(yīng)為22-35個(gè)堿基,Tm>63

引物的最佳GC含量為45-60%53的理想GC含量分別為60-70%40-50%

長(zhǎng)片段擴(kuò)增的引物應(yīng)為25-35個(gè)堿基,Tm>65°C

不能使用含有肌苷的引物

建議使用最近鄰法計(jì)算引物的Tm。本手冊(cè)中的Tm值是使用以下參數(shù)使用該方法計(jì)算的。Na+濃度:50 mM 寡核苷酸濃度:0.5 µM

 

PCR產(chǎn)物的克隆

KOD-Plus-Neo由于其3-5核酸外切酶活性。因此,PCR產(chǎn)物為平端產(chǎn)物,可以根據(jù)平端克隆方法進(jìn)行克隆。

KOD-Plus-NeoPCR產(chǎn)物應(yīng)在限制性內(nèi)切酶處理之前進(jìn)行純化。KOD DNA聚合酶的5-3核酸外切酶活性在PCR反應(yīng)結(jié)束時(shí)仍然存在。

克隆KOD DNA聚合酶產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物推薦專用TA克隆試劑盒“TArget clone™ -Plus- (Code No. TAK-201)"

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系配置

反應(yīng)物準(zhǔn)備前,除酶溶液外,所有成分均應(yīng)wan全解凍。

組分

體積

終濃度

10x Buffer for KOD -Plus- Neo

5 μL

1x

2 mM dNTPs

5 μL

0.2 mM each

25 mM MgSO4

3 μL

1.5 mM

10 pmol/μL Primer #1

0.75–1.5 μL

0.15–0.3 µM

10 pmol/μL Primer #2

0.75–1.5 μL

0.15–0.3 µM

Template DNA

X μL

Genomic DNA ≤ 200 ng/50 μL

Plasmid DNA ≤ 50 ng/50 μL

cDNA ≤ 200 ngRNA equiv.)/50 μL

PCR grade water

Y μL


KOD -Plus- Neo (1.0 U/μL)

1 μL

1.0 U/50 μL

總體積

50 μL


**不要使用其它試劑盒或其它公司的dNTP

注意:

最佳引物濃度為0.3 µM。在長(zhǎng)片段(≥10kb)的情況下,降低引物濃度(0.15µM)可能會(huì)產(chǎn)生更有效的擴(kuò)增。

二甲基亞砜DMSO(終濃度2-5%)的添加有利于擴(kuò)增富含GC的靶標(biāo)。在DMSO存在的情況下,PCR保真度不會(huì)降低(參見步驟2,循環(huán)條件)。

cDNA或基因組DNA中的污染RNA會(huì)通過螯合Mg2+來抑制PCR反應(yīng)。應(yīng)使用<200 ng RNA的模板DNA進(jìn)行PCR

模板DNA的質(zhì)量應(yīng)通過電泳檢查。模板DNA的長(zhǎng)度和純度會(huì)影響擴(kuò)增結(jié)果

含有尿嘧啶的模板不能用于擴(kuò)增。

對(duì)于PCR反應(yīng),建議使用薄壁管。建議總反應(yīng)體積為50 μL

2. 循環(huán)條件

推薦≥20 mer引物,Tm>63°C的兩步循環(huán)條件用于有效擴(kuò)增。

3.jpg 

兩步循環(huán)

如果引物Tm值超過63°C,建議采用兩步循環(huán)。

4.jpg 

注意:

對(duì)于使用低拷貝模板的擴(kuò)增或長(zhǎng)片段(>10kb)的擴(kuò)增,更長(zhǎng)的延伸時(shí)間(高達(dá)1 min/kb)或更高的Mg2+濃度(高達(dá)2 mM終濃度)可以提高產(chǎn)率。

二甲基亞砜DMSO(終濃度2-5%)的添加可能有利于擴(kuò)增富含GC的片段。所用DMSO的濃度應(yīng)根據(jù)引物的Tm來確定。

<25 mer or Tm <68: 2%

25 mer or Tm 68: 5%

如果擴(kuò)增失敗,可能需要3步循環(huán)

步循環(huán)

當(dāng)引物的Tm小于63℃時(shí),應(yīng)使用三步循環(huán)。

5.jpg 

注意:

對(duì)于使用低拷貝模板的擴(kuò)增或長(zhǎng)片段(>10kb)的擴(kuò)增,更長(zhǎng)的延伸時(shí)間(高達(dá)1 min/kb)或更高的Mg2+濃度(高達(dá)2 mM終濃度)可以提高產(chǎn)率。

二甲基亞砜DMSO(終濃度2-5%)的添加可能有利于擴(kuò)增富含GC的片段。

降落PCR

如果在2步和3步循環(huán)條件下觀察到非特異性擴(kuò)增(在PCR產(chǎn)物電泳后觀察到額外的條帶),降落PCR可以提高特異性。

6.jpg 

注意:

對(duì)于使用低拷貝模板的擴(kuò)增或長(zhǎng)片段(>10kb)的擴(kuò)增,更長(zhǎng)的延伸時(shí)間(高達(dá)1 min/kb)或更高的Mg2+濃度(高達(dá)2 mM終濃度)可以提高產(chǎn)率。

二甲基亞砜DMSO(終濃度2-5%)的添加可能有利于擴(kuò)增富含GC的片段。所用DMSO的濃度應(yīng)根據(jù)引物的Tm來確定。

<25 mer or Tm <68: 2%

25 mer or Tm 68: 5%

 

應(yīng)用實(shí)例

性能數(shù)據(jù):

1. PCR保真度

TArget克隆技術(shù)對(duì)從人基因組DNA中擴(kuò)增的人β-珠蛋白基因產(chǎn)物進(jìn)行序列分析,測(cè)定突變頻率KOD-Plus-Neo表現(xiàn)出ji好的保真度,突變頻率與以前版本的酶(KOD-Plus-)相同。

7.png 

2. 延伸能力

根據(jù)每種酶的推薦條件,通過幾種PCR酶從人類基因組DNA中擴(kuò)增出各種大小的片段KOD-Plus-Neo成功擴(kuò)增了17.5 kb片段

8.jpg

3. 低拷貝模板擴(kuò)增

使用0.5 ng cDNA模板擴(kuò)增四個(gè)基因。模板由HeLa細(xì)胞的總RNA合成。KOD-Plus-Neo成功擴(kuò)增了所有基因。

9.jpg

4. 延伸速度

不同的擴(kuò)增時(shí)間從人類基因組DNA50ng)中擴(kuò)增β-珠蛋白基因(3.6 kb)。KOD-Plus-Neo可以用30/kb的延長(zhǎng)時(shí)間擴(kuò)增3.6 kb的靶標(biāo)。

10.jpg 

應(yīng)用數(shù)據(jù):

1. 各種蛋白激酶片段的擴(kuò)增

利用HeLa細(xì)胞總RNA合成的cDNA擴(kuò)增各種蛋白激酶開放閱讀框。KOD-Plus-Neo成功擴(kuò)增了所有片段。

 

2. 長(zhǎng)片段擴(kuò)增

使用不同濃度的引物從人類基因組DNA中擴(kuò)增長(zhǎng)片段。過多的引物會(huì)抑制擴(kuò)增。因此,應(yīng)使用約0.15 µM的較低引物濃度擴(kuò)增長(zhǎng)片段(>10 kb)。

12.jpg 

常見問題及解決辦法

問題

可能的原因

解決辦法

無產(chǎn)物或低產(chǎn)量

循環(huán)條件不合適

使用三步循環(huán),將退火溫度逐漸降低至最大Tm-5–10°C

延伸時(shí)間延長(zhǎng)至1分鐘/kb

將循環(huán)次數(shù)增加2-5個(gè)循環(huán)

Mg2+濃度低

Mg2+濃度增加至2 mM

目標(biāo)序列GC含量高

加入25%DMSO

引物的質(zhì)量和/濃度問題

引物濃度逐步降低至0.15 µM

使用新的引物

重新設(shè)計(jì)引物

模板DNA的質(zhì)量和/濃度問題

檢查模板DNA的質(zhì)量

增加模板DNA濃度

酶濃度低

將酶濃度提高至1.5–2.0 U/50 μL

彌散條帶或雜帶

循環(huán)條件不合適

將循環(huán)次數(shù)減少2-5個(gè)循環(huán)

3步循環(huán)更改2步循環(huán)

2步循環(huán)更改降落PCR

引物的質(zhì)量問題

使用新的引物

重新設(shè)計(jì)引物

模板DNA太多

減少模板DNA濃度

Mg2+濃度太高

MgSO4逐步降低至1.0 mM

酶濃度太高

將酶濃度降至0.50.8 U/50 μL

TA克隆效率差

PCR產(chǎn)物具有平末端

使用專用TA克隆試劑盒TArget clone-Plus-(Code No. TAK-201)

 

參考文獻(xiàn)

1) Takagi M, Nishioka M, Kakihara H, Kitabayashi M, Inoue H, Kawakami B, Oka M, and Imanaka T., Appl Environ Microbiol., 63: 4504-10 (1997).

2) Hashimoto H, Nishioka M, Fujiwara S, Takagi M, Imanaka T, Inoue T and Kai Y, J Mol Biol., 306: 469-77 (2001).

3) Mizuguchi H, Nakatsuji M, Fujiwara S, Takagi M and Imanaka T, J Biochem., 126: 762-8 (1999).

4) Fujii S, Akiyama M, Aoki K, Sugaya Y, Higuchi K, Hiraoka M, Miki Y, Saitoh N, Yoshiyama K, Ihara K, Seki M, Ohtsubo E and Maki H, J. Mol. Biol., 289: 835-850 (1999).

 

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